纯干货丨介绍CAR-T细胞疗法的法规（FDA)

介绍

最近几项临床试验表明，表达靶向肿瘤细胞表面CD19抗原的CAR的转基因T细胞已显着治疗B细胞血液系统恶性肿瘤[7]，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病(CLL) 和非霍奇金淋巴瘤 (NHL)。大多数这些临床试验的T细胞是从从要治疗的患者身上收集的单采产品中获得的。

最近，大奥蒙德街医院和伦敦大学学院儿童健康研究所的研究人员用来自健康供体的单剂量现成CD19 CAR+TCR–CD52–同种异体T细胞治疗了两名患有复发/难治性ALL的婴儿(UCART19)[10]。同种异体CAR特异性T细胞疗法的制造遵循与上述自体CAR-T细胞的转导和扩增阶段或多或少相似的制造过程，不同之处在于制造始于来自单个供体的单采产品，以便为大量患者提供治疗。研究清楚地表明，同种异体CAR-T 细胞不仅可以诱导肿瘤消退，但也驱动GvHD[11,12]。

医疗状况的性质可能决定自体疗法还是同种异体疗法最合适。例如，由于产生自体疗法需要时间，因此在需要紧急护理时，同种异体疗法可能是唯一的选择。由于有可能导致GvHD，需要进一步评估使用供体来源的细胞，尤其是在通往现成T细胞的过程中。目前有许多研究使用多种技术来解决安全问题，以避免GvHD。

从监管的角度来看，当细胞疗法最初发展时，美国食品和药物管理局 (FDA) 很难对其进行监管，因为当时监管是针对不同类型的药物量身定制的。通常本质上是化学的小分子疗法。细胞治疗产品的法规随着时间的推移不断发展，变得相对清晰。

由于CAR特异性T细胞的制造（如上所述）需要我们所谓的“不仅仅是最小操作”（MTMM），因此细胞产品受到《公共卫生服务法》（PHSAAct）第351条的明确监管。第351条下的T细胞产品是一个关键区别，因为第 351 条通常需要通过临床试验途径进行上市前批准。为防止上市许可审批失败，生产、临床前和1期试验的考虑必须仔细驾驭监管环境。

FDA在努力解决与制造CAR特异性T细胞疗法等同的快速发展技术方面取得了重大进展。如框 1 所示，过去十年中产生的大量关于细胞和基因疗法的指导文件证明了这一点。该机构是国际人用药物技术要求协调委员会 (ICH) 的合作伙伴。在细胞和基因治疗领域，制定了几项 ICH 指南（框 1），以便通过与监管和行业专家并肩工作的科学共识过程实现协调一致。

CAR-T细胞的生产制造

目前，CAR-T治疗行业面临着许多挑战，尤其是在现行良好生产规范 (cGMP)下对这些产品的监管生产方面[14]。cGMP在联邦法规(CFR) 第210部分（定义）、211（基本说明）和第11部分（电子数据）中进行了描述。

药品（包括生物药品）的cGMP法规包含对药品制造、加工和包装中使用的方法、设施和控制的最低要求。法规确保产品使用安全，因为它具有声称的成分和强度。遵守cGMP法规可确保药品的特性、强度、质量和纯度，并且是药品制造商充分控制生产操作所必需的。这包括建立强大的质量管理体系、获得合适的优质原材料、建立健全的操作程序、检测和调查产品质量偏差以及保持实验室的可靠测试。面向过程的质量管理体系的组成部分如图1所示。

cGMPs应适用于整个产品生命周期。GMP严格性随着产品从产品开发阶段到商业化阶段而增加（图 2）。例如，早期临床试验中包含的化学、制造和控制 (CMC) 信息可能不如许可申请和批准后修订申请详细。随着有关产品知识的积累，GMP的数据要求（例如工艺验证）会增加。此类信息在临床试验和许可申请的质量部分提交。质量部分包含有关原料药和制剂的质量方面、特性和生产的详细信息。

2008 年7月，FDA 发布了“第一阶段研究药物的 cGMP”指南，豁免大多数用于第一阶段临床试验的研究新药 (IND) 和生物制品的生产符合 21CFR 第211部分下的 21 CFR 210.2(c）。由于 1 期临床试验最初将 IND 引入人类受试者，因此适当的 cGMP 有助于确保受试者安全。本指南作为cGMP的一部分，将质量控制 (QC) 原则应用于 1 期研究药物的生产（即，按照良好的科学方法解释和实施 cGMP），从而促进更适合于1期临床试验的 cGMP 活动，提高 1 期研究药物的质量，并促进人体研究性临床试验的启动，同时继续保护试验受试者[15]。

需要注意的是，在产品开发过程中，应部分通过实施适当的 QC 程序来维持1期研究药物的质量和安全性。使用既定的或标准化的 QC 程序并遵循适当的cGMP也将有助于根据需要为未来的临床试验生产等效或可比的 IND 产品。

在第1阶段研究药物的生产过程中遵守cGMP主要通过以下方式发生：

●定义明确的书面程序

●充分控制设备和制造环境

●准确一致地记录制造（包括测试）数据

满足 CAR-T 细胞制造过程的监管要求意味着解决几个技术挑战，包括设置合适的规格以允许起始材料（自体或同种源）的可变性。患者细胞来源之间的这种固有差异是CAR-T细胞疗法出现更高批次失败的关键原因。定义最终产品的规格以及进行适当广泛的最终产品表征将能够比较试验中的结果并跟踪产品制造过程或制造地点的任何变化。在开发过程中，为了达到所需的规模，还需要进一步优化生产，包括使用完全符合GMP或临床级的试剂，并理想地去除含血清的步骤。由于细胞治疗领域不断发展，GMP质量的试剂并不总是可用的，并且经常需要生物来源的原材料。

另一个公认的关键制造步骤是用病毒载体转导T细胞，以便引入表达CAR所需的基因修饰。为了解决在基于逆转录病毒载体的基因治疗产品中开发具有复制能力的逆转录病毒(RCR)的可能性，需要进行广泛和重复的病毒载体复制能力测试 [16]。RCR可以在制造过程中的任何阶段发展，从最初的主细胞库的开发到逆转录病毒载体上清液的生产。此外，离体转导细胞的生长为任何RCR污染物的扩增提供了可能，这可能低于逆转录病毒载体上清液中的检测水平。因此，当前的测试建议包括测试在产品制造的多个阶段从主细胞库、生产终止细胞和含有来自逆转录病毒载体和离体转导细胞制造的上清液中获得的材料，这些细胞被培养超过 4 天。

这些建议源于早期试验，但最近使用更现代载体构建体的经验表明，没有证据表明设计为无复制能力的载体具有复制能力，用于临床研究的逆转录病毒或慢病毒载体批次样品中没有阳性复制能力结果。过去10年。可以合理地预计，随着更多临床安全性试验的进行并且没有显示RCR的证据，目前所需的复制能力测试的范围可以在未来最小化。

另一个监管关注点是目前使用基因编辑来引入遗传修饰，例如在同种异体CAR-T细胞的制造中选择性删除内源性T细胞受体，以最大限度地减少GvHD。使用当前的基因编辑技术，可以通过使用核酸酶，如锌指核酸酶 (ZFNs)[17]、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)[13,18] 和 CRISPR/Cas9系统等来切除内源性TCR[19]。控制和微调此类平台的靶向特异性的可能性是一个关键问题。这些编辑工具并非万无一失，并且可能会在断裂位点的脱靶位点引入可变长度插入/删除(indel)，从而导致基因编辑事件。脱靶位点被定义为基因组内相对于目标序列包含一些错配的序列。可以通过使用生物信息学评分分析以及无偏见的全基因组方法来确定编码区（基因、染色体位置、基因功能）和非编码区中的这些脱靶位点，并确定没有发生插入缺失脱靶裂解。

临床前试验阶段

在临床前领域，可获取有关临床前测试要求的监管指南[20]。迄今为止，大多数研究CAR-T细胞功能的临床前研究都集中在验证抗肿瘤活性的特异性和效力上。这种特异性通常已通过体外测定得到证实，确定具有特定CAR的T细胞在靶抗原（作为纯化形式或存在于相关靶细胞上）和非特异性抗原之间显示出显着差异的功能反应。此类检测证明了CAR功能并支持转化为动物模型系统。对于转基因T细胞，除了评估产品和所涉及病毒载体的安全性外，挑战在于评估相关功效模型的相关性和实用性。在大多数情况下，使用基于风险的方法将有助于制定非临床策略。

在这种方法中，应在临床前研究中解决以下要素：

●进行临床试验的科学依据

●推荐人类初始安全剂量和剂量递增方案的数据

☆识别潜在的毒性/活性靶组织

☆确定临床监测参数

☆确定患者资格标准

●相关动物模型中的概念验证研究

☆功能矫正的程度

☆效果持久度

☆确定有效剂量水平范围

☆优化给药途径/剂量选择/给药方案

●在动物模型中收集安全数据

☆相关动物物种的毒理学研究

☆识别、表征、量化潜在的局部和全身毒性

◎确定毒性靶器官/部位

◎可逆性（急性或慢性毒性）

◎剂量反应关系

监管机构通常需要有关特定试剂的信息，在这种情况下是CAR-T细胞。可以预料，为CAR-T细胞产品生成的临床前数据可能无法得到最佳评估，也无法像小分子药物生成的数据一样提供信息，特别是因为进行传统的临床前药代动力学(PK)研究通常是不可行的与细胞和基因治疗产品。

大多数免疫受损小鼠的人类T细胞移植是有限的。由于CAR-T细胞的人类特异性，由于异种免疫反应可快速靶向和消除人类细胞，并且 CAR-T细胞的scFv无法与来自其他物种的靶向抗原。尽管如此，一些研究已经表明使用裸体、NOD/SCID 或 SCID/米色动物的 CAR-T 细胞功能的功效 [21-24]。最近，高度免疫缺陷的小鼠异种移植模型 NOG/NSG 小鼠 (NOD/SCID IL-2Rγ-/-) 的可用性允许有效的人类 T 细胞植入和相应的公认的人类肿瘤细胞。该动物模型已广泛用于评估 CAR-T 细胞疗法的体内活性。虽然这些模型在靶向/非肿瘤细胞毒性和脱靶细胞毒性方面存在局限性，并且完全消除了 MHC 错配的任何作用，但它们已被证明对于评估 CAR-的体内抗肿瘤功效非常有用。T细胞。它们已成为评估 CAR-T 细胞产品体内活性的事实上的标准[25-31]。它们已被证明能够区分不同 CAR 的相对抗肿瘤活性，突出了它们捕获和半定量读出有用的人类体内 T 细胞功能的能力[32]。

然而，已经观察到移植的 T 细胞可以导致异种移植物抗宿主病 (xGvHD)，这种疾病发生在过继 T 细胞移植后 50 天左右，剂量高于 109 个细胞/kg [33]。xGvHD 的发生与转导细胞的持久性有关，这受到在注射到小鼠体内之前用于培养细胞的细胞因子条件的影响。因此，这限制了研究 CAR-T 细胞在该模型中的长期影响的能力 [33-35]。

目前，临床前模型系统也被用于确定试验中观察到的不良事件是否可以在小鼠中重现，以允许检查驱动毒性的潜在机制。目前，在很大程度上，还没有实现对临床情况的这种概括。CD19 CAR-T 细胞在 BALB/c 自体模型系统中诱导的毒性并不能完全反映在患者中观察到的毒性，特别是考虑到 IL-6 似乎不像在患者中观察到的那样是急性毒性的主要驱动因素 [36] 。此外，Her2/neu 靶向 CAR-T 细胞未能在临床前模型中显示出任何自体毒性证据，但接受此类 CAR-T 细胞的患者死亡，这可能是由于存在靶向 Her2/neu 而释放的细胞因子所致对肺上皮细胞的研究 [37] 证明了该疗法的效力，并突出了当前模型系统的预测性差。临床前结果和患者情况之间存在这种二分法的原因尚不清楚，但可能包括诸如 CAR 结构的差异、小鼠和人类之间的 T 细胞生物学以及物种之间不同的药物代谢能力等因素[38]。

随着对临床毒性的观察，现在有更强烈的动力去更好地了解潜在的毒性机制。虽然当前模型的预测性差可能与啮齿动物和人类之间的生物学差异有关，但当 CAR 能够同时使用人类和鼠类同源物时，可以实现更强大的毒性测试[39]。

良好实验室规范 (GLP) 预计将在支持或旨在支持 FDA 监管的产品（包括生物产品）的研究或营销许可申请的非临床实验室研究中得到遵循。GLP规定了一个质量体系，涉及非临床健康和环境安全研究的计划、执行、监控、记录、存档和报告的组织过程和条件。GLP是在《联邦法规》（21CFR 第 58 部分）中发布的法规。GLP的基本要素见方框 2。

临床试验阶段

为 CAR-T 细胞疗法启动的临床试验设计并未模仿通常用于小分子药物安全性和有效性测试的传统 1-2-3 期开发途径。试验设计的差异是这些产品的独特特征所必需的，也可能反映了以前的临床经验。这些可能导致其风险的特征包括单次给药后生物活性延长的潜力、免疫原性的高潜力或需要相对侵入性的程序来管理产品。与许多小分子药物不同，制造 CAR-T 细胞产品的物流和可行性更多地影响临床试验的设计。因此，CAR-T细胞产品的早期临床试验设计，往往会涉及临床安全性问题、临床前问题和CMC问题，而这些问题在其他药物的开发中并不常见或根本不存在。

早期临床试验通常直接在患者身上开始，并且通常以收集所需数据的方式进行。21 CFR Part 312 中的 IND 规定强调了试验风险评估和试验受试者保护措施的重要性。对于早期临床试验，尤其是首次人体试验，主要目标应该是安全性评估 [40]。安全性评估包括对潜在不良反应的性质和频率的评估以及与剂量关系的估计。考虑最佳剂量和给药方式，确定合适的患者群体和剂量递增的交错。在确定最佳剂量和给药方案时，必须考虑起始剂量水平/剂量递增方案、给药途径和给药方案。如果要使用免疫抑制，则必须考虑其他因素，例如：

●剂量计划的合理性

●免疫抑制方案的长期与短期影响

●单一药物与联合方案

除了研究产品的差异外，CAR-T细胞治疗方案的其他差异包括淋巴耗竭的类型和强度、抗CD19 CAR-T细胞输注的时间和剂量，以及目标患者人群和恶性肿瘤。

在CAR修饰的T细胞临床试验中，已证明影响 T 细胞植入和增殖的一个因素是在T细胞输注前对患者使用淋巴清除化疗 [41,42]。这种预处理为注入细胞的扩增创造了空间，限制了对稳态γ链细胞因子IL-2、IL-7和IL-15的竞争，消耗了调节性 T 细胞，并激活了先天免疫系统。这通常由非清髓性化疗方案组成，通常由一个疗程的环磷酰胺加氟达拉滨在输注前组成。这种化疗和预处理的结合减少了可以抑制 CAR-T 细胞有效的免疫抑制细胞的数量。Lymphodepletion可能具有肿瘤细胞减少的额外好处，这可能会提高CAR-T细胞的治疗效果并最大限度地减少毒性。然而，值得注意的是，一些患者在没有先前淋巴细胞清除的情况下对CAR-T细胞疗法有反应[43]。

例如，根据瑞典乌普萨拉大学的 Angelica Loskog 教授提供的数据，在 1/2a 期试验中，第三代 CD19 CAR-T 细胞疗法联合化疗预处理在一些淋巴瘤和白血病患者中产生了完全反应。2015 年 9 月举行的 CRI-CIMT-EATI-AACR 国际癌症免疫治疗会议。Loskog 及其同事测试了将化疗与预处理相结合以减少免疫抑制细胞数量是否可以改善治疗结果。6 名患者，其中 3 名患有白血病，3 名患有淋巴瘤，完全缓解。其中两人后来复发。在完全缓解率的患者中，有 5 人接受了预处理。在 CAR-T 细胞输注前一天未接受预处理治疗的前 5 名患者中，只有 1 名患者初始完全缓解，其余患者疾病进展迅速。

在疾病负担显着的患者中，尤其是伴有广泛骨髓浸润的 ALL 或伴有大块淋巴结病的非霍奇金淋巴瘤患者，许多组在预处理化疗或细胞输注之前开始使用别嘌呤醇预防肿瘤溶解综合征 (TLS) [43-45]。

鉴于 CAR 修饰的 T 细胞的极端效力，使用这种疗法本身已显示出显着的毒性潜力 [38,45–47]。毒性范围从危及生命的细胞因子释放综合征 (CRS) 和巨噬细胞激活综合征 (MAS) 到靶向肿瘤外毒性、神经毒性和 TLS。Lee 等人已经阐明了评估和管理 CAR-T 细胞给药后毒性的指南，例如 CRS 的诊断和管理。[48]。CRS 的标志是免疫激活导致炎症细胞因子升高。临床和实验室测量范围从轻度 CRS（全身症状和/或 2 级器官毒性）到重度 CRS（sCRS；≥3 级器官毒性、积极的临床干预和/或可能危及生命）[48]。在诊断出 CRS 后，选择合适的疗法来减轻不受控制的炎症的生理症状而不削弱工程细胞的抗肿瘤功效一直是一个挑战。已证明全身性皮质类固醇给药可快速逆转 sCRS 的症状，而不会影响初始抗肿瘤反应 [49-50]。然而，长期使用（例如，>14 天）高剂量皮质类固醇也会导致过继转移的 CAR-T 细胞群消融，这可能会限制它们的长期抗白血病作用 [49]。作为使用 FDA 批准的 mAb 阻断 IL-6 受体 (IL-6R) 的有效替代方案，托珠单抗已证明几乎立即逆转 CRS [43,51]。

CAR-T 细胞引起的毒性是多种多样的，尚未完全了解。管理需要警惕的监测、积极的支持治疗，在某些情况下还需要重症监护。使用免疫抑制剂来降低毒性是一种不断发展的实践。毒性分级和管理的共识指南将促进更多中心对 CAR-T 细胞的管理。改进 CAR-T 细胞毒性的管理是全面改进 CAR-T 细胞疗法领域的最重要途径之一。

Brudno和Kochederfer的一篇综述描述了CAR-T细胞引起的毒性以及用于管理毒性的已发表方法。它还提供了治CAR-细胞治疗后出现CRS和其他不良事件的患者的指南 [52]。

由于早期试验的主要目标是评估安全性，因此早期试验应采用一般测试和监测来寻找预期和意外的安全问题。一般安全监测通常包括症状和常见临床测量的记录，例如身体检查、化学特征、全血细胞计数和可能适合所调查病症的其他检查。方框 3 概述了预期的患者和临床安全监测。

试验设计可能具有挑战性，同时需要对接受基因改造治疗的患者进行长期随访，通常为 15年。很可能需要进行患者登记以满足长期随访需求，监管机构可提供与此相关的指导文件 [53-55]。

总之，在根据IND申请启动首次人体剂量发现（第一阶段）临床研究之前，应制定产品表征的初步规范。这些免疫治疗产品的产品放行规范是根据IND申办者对其产品（和其他类似产品，如果有）的先前经验制定的，并包括基于CFR 要求和FDA发布的指导文件的分析程序。随着产品开发的进行，产品质量和制造一致性的更多和更窄的规范应根据获得的数据实施（图 3）。在旨在支持上市申请（第 3 阶段）的临床试验开始时，批签发和其他产品规格应基于产品开发期间收集的所有信息，并与临床研究期间生成的数据保持一致。在进行第 3 阶段试验期间，应进行或完成对产品测试分析程序的验证。

 doi:10.18609/cgti.2017.030