CAR-T细胞疗法的发展方向

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目前大多数可用的 CAR-T 疗法都是使用慢病毒制造的。由于制造过程耗时，大约有 10%的患者因为疾病在接受治疗之前进展而死亡。因此，制造时间的减少引起了相当多的关注，因为这将使患有侵袭性疾病的患者能够接受治疗，并有助于患者维持T细胞的干亚型比例[100]。

快速生产

一项名为FasT CAR-T的新技术将制造时间缩短至仅24小时，并已在中国新桥医院进行I期临床试验（编号：ChiCTR1900023212）。患者可以在短时间内接受这种类型的 CAR-T细胞治疗，第一个试验导致10名患者在CAR-T细胞输注4周后全部达到CR；其中9名患者的MRD也呈阴性。主要不良事件是CRS，在 9 名患者中观察到。三名患者在输注CAR-T后出现CAR相关脑病综合征 (CRES)。所有发生 CRS 或 CRES 的患者在干预后均康复（未发表数据）。

基因转导

病毒感染的潜在风险和可能的随机插入可能导致T细胞功能丧失或获得，从而可能导致无限增殖；一份关于白血病 CAR-B 细胞培养不当导致致命复发的病例报告已经发表，这激发了对非病毒介导的转导方法的研究[20]。

睡美人和 PiggyBac 转座是基于非病毒的技术，它们能够在更短的时间内处理T细胞，同时产生更高比例的DNA损伤有限的中央记忆T细胞[101-104]。理论上，这个过程延长了CAR-T细胞的持久性，避免了DNA损伤的潜在风险。使用睡美人系统制造的 CAR-T 细胞基于较短的培养时间，其初步结果显示，6名患者具有抗肿瘤效果，但未引起临床上显着的CRS [102]。

PiggyBac 已被用于制造HLA匹配的抗CD19 allo-CAR-T 细胞，并且在一项临床试验中，所有7名受试者都实现了CR，表明其安全性和活性与病毒载体产生的CD19 CAR-T 细胞相似[105]。但是，必须通过进一步的临床试验来验证长期益处。除了降低与病毒载体相关的风险和制造时间外，制造技术改造也被认为是降低成本的有效方法。

基因编辑

制造技术的进化不仅限于CAR基因转导。还采用基因编辑技术来提高CAR-T细胞抵抗TME的能力，降低免疫原性。最流行的途径是PD-1途径。下一代CAR-T细胞包括CRISPR/CAS9等几种基因编辑方法，通过沉默或敲除编码PD-1的基因来破坏该通路对CAR-T细胞的抑制作用。基于数个PD-1干扰的CAR-T细胞疗法用于实体瘤的临床前研究结果证实的肿瘤杀伤功效增加[106, 107]，PD-1敲除CAR-T的临床试验T细胞已经开始招募患者（表2）。

PD-1 KO工程化抗MUC1 CART细胞用于治疗晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的临床试验的主要结果显示，20名接受评估的患者中有11名病情稳定，而9个经历了疾病进展。所有患者在输注后症状均明显改善。然而，适当的剂量和周期仍有待探索[108]。

此外，还提出了更具体的编辑，以最大限度地降低基因编辑脱靶副作用的潜在风险。PD-1 N-连接糖基化的减少可能会降低PD-1的表达并减轻其对CAR-T细胞的抑制作用。因此，一项使用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）通过改变CAR-T细胞中的糖基化残基来减少PD-1抑制的临床前研究下调了CAR-T细胞中PD-1的表达并增强了体外和体内的细胞毒功能[11]。尽管沉默的PD-1提高了CAR-T细胞的功效，但对持久性的负面影响可能会损害CAR-T细胞疗法的总体益处。

在一项临床前研究中，PD-1阻断的 CAR-T 细胞在体外或体内均未表现出更好的抗肿瘤功能。PD-1 敲低可能会削弱CAR-T细胞的抗肿瘤潜力，因为它会抑制T细胞增殖并加速T细胞的早期分化并阻止效应T细胞分化为效应记忆T细胞。因此，PD-1可能在维持T细胞的适当增殖和分化，以及 PD-1 沉默会通过抑制T细胞的增殖来损害它们的抗肿瘤功能[109]。

因此，下一个目标是部分抑制PD-1信号通路，以维持CAR-T细胞的增殖和分化，同时提高对TME的疗效和抵抗力。此外，随着对细胞内网络的探索，通过改变NR4A等转录因子的表达来调整激活 [110] 可能更准确，这在临床前研究中也产生了显着的结果，并揭示了下一代 CAR 的未来-基于表观遗传修饰的T细胞。

然而，与基因编辑相关的风险应该始终是一个问题，因为所有产品都应保持对化疗或其他疗法的脆弱性，以确保对注入细胞的控制。还应考虑自杀基因以确保安全，因为我们并不完全了解基因编辑的影响。

通用CAR-T

目前大多数可用的CAR-T细胞来自从患者身上采集的T细胞，这些 T 细胞被制造成 CAR-T细胞。然而，接受CAR-T疗法治疗的 R/R 血液系统恶性肿瘤患者通常接受了一系列化疗，其中一些患者在HSCT后出现了明显的复发。高肿瘤负荷和T细胞群的缺乏增加了在单采后获得足够数量的合格T细胞的难度，特别是对于患有T细胞恶性肿瘤的患者。

对于有合适供者的患者，allo-CAR-T疗法已被证明适用于I期临床试验和接受辅助allo-HSCT的人[111-114]。allo-HSCT会导致严重的移植物抗宿主病 (GVHD) 的推测被证明是不必要的[115]。在对72名在坦率B细胞恶性肿瘤复发后接受抗CD19 allo-CAR-T细胞的患者进行系统评价后，只有5名患者经历了GVHD [116, 117]。

对于没有匹配供体的患者，来自健康供体的“现成”CAR-T细胞可能是唯一可用的选择。在第一项检查其可行性的研究中，来自健康供体的初级通用CAR-T(U-CAR-T) 细胞被淘汰得太快而无法发挥作用，部分原因是敌对宿主自然杀伤 (NK) 细胞和T细胞杀死不相容的细胞（包括但不限于T细胞受体）输注的细胞。然而，有一些例子表明，由于患者免疫系统的抵抗力较弱，U-CAR-T细胞被成功植入患者体内。在理想模型中，当恶性细胞上的靶抗原提供足够的刺激时，U-CAR-T细胞就会存活下来。当恶性细胞被清除并且宿主免疫系统恢复时，U-CAR-T细胞就会被清除。

对于没有HLA匹配限制的γδ-T细胞，最丰富的γδ-T细胞表达Vγ9 Vδ2 TCR，它识别异戊烯焦磷酸 (IPP)，它在癌细胞中过量产生。共刺激域-CAR γδ-T细胞被认为是一种更安全的疗法，因为CAR仅遵循一种途径来刺激免疫反应，并且细胞毒性仅限于IPP抗原诱导的反应[121, 122]。此外，已经成功建立了一个大型扩展平台，这有可能使γδ-T细胞成为现成的产品和U-CAR-T细胞疗法的可能来源[123]。

另一种生成避开宿主免疫系统的细胞的方法是基因编辑。锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR/CAS9技术能够敲除TCR和其他排斥相关表位，如 CD52。抗CD19 TALEN编辑的TRAC和CD52-KO U-CAR-T细胞疗法用于成人和儿童B细胞恶性肿瘤患者的初始临床试验（NCT 02746952 和 NCT02808442）导致88%的可评估患者获得CR或 CRi（14/16) 到移植后第28天或第42天，并且这些患者中有 86% (12/14)为MRD阴性，如流式PCR或qPCR所确定。两名患者未能做出反应并且未表现出U-CAR-T细胞的扩增[124]。

与auto-CAR-T细胞相比，U-CAR-T细胞不太可能在患者体内长期存在，因为其异质性涉及的表位多于我们能够删除的表位。因此，U-CAR-T细胞治疗可能代表了一种有效的方法，可以及时实现CR，使患者受益，而不是作为一种无需进一步治疗的持久解决方案。目前主要包括移植在内的潜在后续治疗需要进一步探索。

CAR-NK是很好的替代

免疫原性较低且具有良好的肿瘤杀伤活性的免疫细胞，如NK细胞，代表了一种有潜力替代T细胞并用于通用免疫细胞治疗的细胞类型，因此，研究人员专注于CAR NK的开发细胞。然而，与T细胞相比，NK细胞的增殖和持久性降低。

NK92 细胞（一种源自NK细胞淋巴瘤患者的稳定白血病NK细胞）在临床前研究中显示出消除多种血液和实体肿瘤的潜力 [128]，并且NK92细胞的临床级制造平台也已建立，以满足需要质量和数量来克服这个问题[129]。一项表达4-1BB共刺激结构域的抗CD33 CAR NK92细胞治疗AML的临床试验招募了3名患者，其中一名患者出现了短期MRD+缓解。反应率差可能是由于剂量不足和受试者数量有限[130]。

此外，NK细胞的有效共刺激域不同于T细胞。因此，像2B4这样的刺激域的开发可能是增加植入和延长持久性的解决方案[131]。

此外，用于第四代的模型也可能在CAR NK治疗中有效。例如，分泌的IL-15也能够增加患者对CAR NK细胞疗法的反应。通过增强，来自健康成人供体并由脐带血干细胞诱导的NK细胞的失血是CAR NK细胞治疗的有效且廉价的来源[132,133]。在临床前研究中，CAR NK细胞在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中被成功设计和测试[134-136]。临床试验已在全球范围内启动（表 3）。

抗 CD19 IL-15分泌型CAR NK细胞治疗B细胞淋巴瘤和CLL患者的主要结果表明，11名复发或难治性CD19阳性癌症患者中有8名（73%）获得了缓解；在这些患者中，7名（4名淋巴瘤患者和3名CLL患者）获得了CR，1名患者实现了Richter转化成分的缓解，但患有持续性CLL。在所有剂量水平输注后30天内观察到反应迅速。注入的CAR-NK细胞在低水平扩增并持续至少12个月[137]。

综上所述，CAR NK细胞疗法作为一种通用细胞疗法显示出巨大的潜力，与UCAR-T细胞疗法类似，应考虑后续治疗。

总结

CAR-T 细胞疗法的成本应通过技术进步和通用 CAR-T 细胞和 CAR NK 细胞疗法的发展来降低，以被大多数患者和付款人接受。

参考资料：Recent advances in CAR-T cell engineering.

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